Выделение генов

Возможно использование нескольких путей выделения генов. Каждый из них имеет свои достоинства и недостатки.

Это был ген аланиновой т-РНК дрожжей размером в 77 п. н. В то время это было выдающееся достижение науки.

Еще более значительным событием стал искусственный синтез гена тирозиновой т-РНК, проведенный тем же исследователем в 1976 г. Этот ген включал области промотора и терминатора, а главное, он был биологически активен, т. е. работал при введении в клетку.

Получение отдельных генов из молекулы ДНК из природного генетического материала впервые осуществил Дж. Беквит в 1969 г., выделив гены лактозного оперона E. coli.

Главную роль в этом методе играют ферменты рестрикции (разрезания ДНК) – рестриктазы. Такие ферменты синтезируются практически всеми бактериями. Они относятся к группе ферментов-эндонуклеаз, которые делают разрезы в молекуле ДНК.

Собственная ДНК организма, продуцирующего рестриктазу, обычно модифицирована по участку узнавания, чтобы предотвратить саморасщепление.

Модификация осуществляется посредством включения в ДНК бактерии модифицированных азотистых оснований особой ферментативной системой модификации.

Ферменты рестрикции и модификации представляют собой единую систему. Эта система является своеобразным барьером, предохраняющим клетку от проникновения чужеродного генетического материала и включения его в собственный геном.

Структура многих сайтов рестрикции-модификации в настоящее время расшифрована. Ферменты бактериальной клетки могут модифицировать ДНК внедрившегося фага еще до того, как его атакуют рестриктазы.

В этом случае фаговая инфекция приведет к лизису клетки, а все потомство такого фага будет содержать также модифицированную ДНК. Оно будет способно заражать другие бактерии с такой же системой репарации.

Эти методы сыграли судьбоносную роль в становлении геномики и генной инженерии. Методы секвенирования основаны на создании набора одноцепочечных фрагментов ДНК, оканчивающихся определенным нуклеотидом, для чего используются специфические рестриктазы.

Разработаны разные методические подходы секвенирования и способы выделения набора фрагментов. В настоящее время высокий уровень технического оснащения сделал секвенирование достаточно рутинной лабораторной работой.

Синтез генов путем обратной транскрипции первоначально представлялся наиболее перспективным.

Выделенную с помощью зонда м-РНК можно использовать для синтеза комплементарной ДНК (к-ДНК) путем обратной транскрипции. После синтеза одной цепи с помощью ДНК-полимеразы можно синтезировать вторую цепь.

Большим недостатком этого метода является отсутствие регуляторных элементов в синтезированных генах, необходимых для экспрессии. К тому же часто к-ДНК является упрощенной копией гена, поскольку содержит только его кодирующую часть, т. е. экзоны (без интронов).